События игры развиваются в конце XV — начале XVI века. События игры, развивающиеся в сегодняшнем времени, происходят на территории Италии. Assassin’s Creed: Brotherhood является прямым сиквелом игры Assassin's Creed II. Сюжет развивается непосредственно после окончания событий оригинальной игры. Главным героем игры является итальянский дворянин-ассасин Эцио Аудиторе де Фиренце, который продолжает свою борьбу с орденом тамплиеров в Риме.

Игра Assassin’s Creed: Brotherhood завершает сюжетную линию Эцио.
Геймплей
Геймплей игры стандартен для серии Assassin’s Creed и является развитием игрового процесса Assassin's Creed II. Как и в предыдущих частях, основой механики игры является паркур, использование толпы и различных укрытий для незаметных убийств («стелс») и развитой системы ближнего боя. Открытый мир игры представляет некоторою степень нелинейности прохождения, хотя основные сцены игры и её хронологические рамки выстроены с помощью системы скриптов. Непосредственное прохождение сюжетной линии занимает около 15 часов.Кроме того, к игрокам вернулась возможность переигрывать все сюжетные миссии игры.

Действие игры преимущественно происходит в Риме XVI века, однако периодически события переносятся в современность, где главным героем является Десмонд Майлз (англ. Desmond Miles), обучающийся искусствам ассасина с помощью машины «Анимус 2.0» (лат. anima — душа), позволяющей считывать генетическую информацию о предках Десмонда и погружать его в прошлое. Главный герой исторической части игры — Эцио Аудиторе де Фиренце (англ. Ezio Auditore da Firenze), один из лидеров и наставников ордена ассасинов. Злейшие враги ассассинов — представители влиятельного клана Борджиа, полностью контролирующие политику Рима и его коррумпированных лидеров.

По сравнению с предшествующей игрой, боевая система не претерпела серьёзных изменений. По словам разработчиков, динамика боя стала более активной и наступательной. Теперь поощряется быстрое наступление; контратаки стали менее эффективными. Система поведения NPC стала агрессивной, игрока атакуют сразу несколько противников. Увеличилось количество оружия, появилась возможность использовать стационарные пушки в некоторых игровых ситуациях. Кроме того, серьёзно пересмотрена роль лошади, на которой теперь можно передвигаться и в пределах города. Лошадь участвует в некоторых элементах паркура.

В процессе выполнения заданий Эцио встречает и взаимодействует с различными историческими персонажами, такими как Леонардо да Винчи, Никколо Макиавелли, Катерина Сфорца; представители рода Борджиа являются основными противниками игры.Сюжет игры в целом чётко вписан в исторические рамки.